GOP-1.1.1-09/1-2009-0054 projekt

PROJEKTISMERTETŐ

„Komplex sejtkultúra- és membránvezikula-alapú in vitro szolgáltatáscsomag fejlesztése kolesztatikus anyagok nagy érzékenységű preklinikai szűrésére” című

GOP-1.1.1-09/1-2009-0054 projekt

Kedvezményezett: Solvo Biotechnológiai Zrt., 6726 Szeged, Közép fasor 52.

A projekt az Új Magyarország Fejlesztési Terv Gazdaságfejlesztési Operatív Programja keretén belül valósul meg.

A projekt összköltsége: 88.007.835 Ft

Elnyert támogatás: 58.965.249 Ft

Futamidő: 25 hónap (2010. 03. 01 – 2012. 03. 31.)

Projektvezető: Dr. Kis Emese

Közreműködő szervezet: MAG- Magyar Gazdaságfejlesztési Központ Zrt., 1139 Budapest, Váci út 83.

HÁTTÉR

A gyógyszerfejlesztésben a hatóanyagjelöltek jelentős része előnytelen farmakokinetikai tulajdonságaik miatt bukik meg, például felszívódási vagy kiürülési problémák miatt. A hatóanyagok ezen tulajdonságainak jellemzése ezért nagyon fontos preklinikai fejlesztési szempont. Az egyes élettani határfelületeken (pl. vékonybél, máj) a sejtmembránokban működő transzporterfehérjék a gyógyszer-jelöltek farmakokinetikai/ADME tulajdonságait jelentősen befolyásolják, ezért a hatóanyag–transzporter kölcsönhatás mérések értékes információval szolgálnak a gyógyszerfejlesztőknek.
Mivel az emberi szervezetben a májnak központi szerepe van a gyógyszerek anyagcseréjében, továbbá a máj bizonyos gyógyszerek ürítésében is kulcsszerepet játszik, a májon végzett vizsgálatok eredményei döntő jelentőségűek. Ha egy vegyület hatására a májban epepangás (kolesztázis) alakul ki, akkor a kérdéses szer gátolja az epeürülést. Ezek a kolesztázist okozó anyagok nem kerülhetnek már klinikai kipróbálásra. A hepatotoxicitás miatt egyébként már több bevezetett gyógyszert is visszavontak a piacról (pl. Troglitazone), ezért a szóban forgó fejlesztés klinikai relevanciája is jelentős.
A gyógyszerhatóanyag által kiváltott epepangás kockázatának meghatározását szolgáló mérési eredmények különösen a fejlesztés preklinikai szakában hasznosíthatók. A projekt keretében fejlesztett technológián alapuló szolgáltatásokat az originális gyógyszereket fejlesztő vállalati ügyfeleknek kívánjuk értékesíteni.

A PROJEKT CÉLJA

A projekt célja egy új, gyógyszer/kozmetikum-hatóanyagok által okozott kolesztázis kockázatának becslésére, és a kialakult kolesztázis transzportermediált mechanizmusának meghatározására alkalmas in vitro eljárás kidolgozása. Az eljárás alapja a máj transzportfunkcióit modellező, humán máj eredetű HepaRG sejtvonal használata szendvicskonfigurációban. Az immortalizált sejtvonal ötvözi a primer hepatociták tulajdonságait (metabolizmus, transzporterfehérjék expressziója) a sejtvonalak állandó osztódási képességével. Ezzel egy olcsóbb és könnyebben hozzáférhető technológiát nyerünk, kiküszöbölve számos etikai problémát, amelyek eddig az emberi májszövet alkalmazásából adódtak. Mivel gyógyszermolekulák májon keresztüli transzportjának tanulmányozására kevés standardizált módszer létezik, a szendvicskultúrából és az izolált membránfrakciókból származó eredményeket kombináló szolgáltatáscsomag a piacon egyedülálló előnyöket kínál.
A K+F tevékenység összefoglalása:
• Májszendvics létrehozása, epekapilláris-képzés és transzporterfehérje-expressziók igazolása.
• Vektoriális transzport igazolása ismert szubsztrátokkal (gyógyszerek) és izolált kanalikuláris vezikulákon.
• Kanalikuláris és basolaterális és membránvezikulák preparálása, bevizsgálása.
• A kolesztázis kialakulását jelző paraméterek meghatározása és bemérése.
• A kolesztatikus folyamatok faji különbségeinek vizsgálata (egér/patkány/humán), kereszt¬validálások.
A máj transzportfunkcióinak tanulmányozására jelenleg elfogadott modell a szendvicskonfigurációban tartott hepatocitákon végzett kísérletek. Ebben a konfigurációban a májsejtek fiziológiás módon megtartják a metabolizmusért és transzportfunkciókért felelős fehérjék expresszióját, epekanalikulusokat képeznek. A jelen gyakorlat alapján azonban a humán eredetű májsejtek helyett patkánysejteket használnak, amely bizonyítottan nem alkalmas a humán májban zajló folyamatok visszaadására. Más oldalról a humán primer hepatocitákra fejlesztett rendszerek hátránya a donoronként nagy egyedi szórás és a magas ár. E nehézségeket hidalná át egy jól karakterizált és validált HepaRG sejtvonalalapú rendszer.
Fentieket kiegészítik az egyes transzportereket expresszáló membránvezikulákon (efflux transzport), ill. sejtvonalak (uptake transzport) végzett gyógyszer-interakciós vizsgálatok. A vezikulák a fiziológiáshoz képest sokkal nagyobb mennyiségben tartalmazzák a vizsgálandó fehérjét, biztosítva a rendszer robusztusságát, azonban az ilyen rendszerekből nyert információ in vivo relevanciája alacsony. Célunk a primer hepatocitákból, ill. differenciálódott HepaRG sejtekből izolálni kanali¬kuláris és bazolaterális membránfrakciókat, melyek fiziológiás szinten tartalmazzák a releváns transzporterfehérjéket.
A projektben közreműködik az MTA Kémiai Kutatóintézet Farmakobiokémiai Osztály metabolizmus laboratóriuma.

A PROJEKT TEVÉKENYSÉGEI

1. Epekapillárisok morfológiai és funkcionális jellemzése különböző sejtmodellekben
Az 1. feladat során összehasonlítjuk a szendvicskonfigurációban tartott patkány-, humán hepatociták és HepaRG sejtek epekapilláris képzését, vektoriális transzport tulajdonságait, és kiválasztjuk a későbbi teszteléshez legalkalmasabb kísérleti modellt és eljárást. A feladat része a vizsgált transzporterek proteinexpressziójának meghatározása minden sejttípusban.
2. Kanalikuláris membránizolálás és jellemzés
Ebben a munkafázisban valamennyi sejttípusból kanalikuláris membránpreparátumot készítünk, és meghatározzuk a vizsgált transzporterek expresszióját és aktivitását.
3. Kolesztázis mechanizmusának vizsgálata 1.
E feladat során választjuk ki a későbbi teszteléshez használt kolesztatikus gyógyszereket, meghatározzuk mely transzporterek érintettek a kolesztázis kialakulásában az 1. feladat során kidolgozott sejtmodellekben. Teszteljük a kolesztatikus gyógyszerek hatására történő transzporter protein expresszió változását. A kolesztatikus gyógyszerek hatását transzportermodulátorok (ismert gátlószerek) jelenlétében is vizsgáljuk.
4. Kolesztázis mechanizmusának vizsgálata 2.
A 3. feladat során kiválasztott vegyületek tesztelése vezikuláristranszport-kísérletekben, amelyek tartalmazzák a patkány- és humán transzporterek valamelyikét. IC50 meghatározás.
5. Kolesztatikus gyógyszerek toxikológiai vizsgálata különböző sejtmodellekben
A kolesztatikus gyógyszerek akut és krónikus adagolásának toxikus hatását vizsgáljuk ebben a feladatban. A 3. feladat során kiválasztott vegyületek különböző dózisú egyszeri és ismételt adagolásának citotoxikus hatását teszteljük valamennyi sejtkultúrában
6. Kolesztatilus gyógyszerek krónikus adagolásának vizsgálata
A kolesztatikus gyógyszerek hosszabb idejű adagolásának hatását teszteljük valamennyi sejttípuson. Valamennyi sejtmodellben a sejteket legalább 3 napig kezeljük a 3. feladat során kiválasztott vegyületekkel, és vizsgáljuk a transzporterproteinek mennyiségének, valamint aktivitásának változását a 3–4. feladatban leírt módszerekkel.
7. A kolesztatikus gyógyszerek in vivo hatása
Ebben a munkafázisban ex vivo májperfúziós kísérletekben vizsgáljuk, hogy hogyan hatnak a kolesztatikus gyógyszerek a biliáris efflux transzporterekre, összehasonlítjuk az előző munkafázisban kapott in vitro adatokat az ex vivo kísérletek eredményeivel. A transzporterek specifikus szubsztrátjaival egy időben adjuk a 3. feladatban kiválasztott vegyületeket, és állatkísérletekben vizsgáljuk a szubsztrátok epébe történő kiválasztásának változását.
8. Eredmények elemzése, disszeminációja, marketing
A kapott eredmények elemzése során az egyes kísérleti rendszerekből nyert eredményeket külön és egymással összehasonlítva (korrelációk megállapítása) fogjuk vizsgálni. Elemezni fogjuk a jellemző szubsztrátok transzportkinetikai paramétereit vezikuláris transzportban (2. feladat), és szendvicskultúrában (1. feladat). Emellett a tanulmányozott kolesztatikus gyógyszerek hatását hasonlítjuk össze a kétféle in vitro módszer és in vivo eredmények segítségével. Előkészítjük a szolgáltatáscsomag termékesítését, ismételt piacfelmérést végzünk ügyféladatbázisunk alapján. Az eredményeket nemzetközi konferenciá(ko)n előadjuk/posztert adunk be.